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細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒的使用方法
點擊次數:2081 發布時間:2013-01-23
  使用說明:
  
  1.準備溶液:溫融解試劑盒中的三種試劑,溶解后立即放置在冰上,混勻。取適當量的細胞漿蛋白抽
  
  提試劑A備用,在使用前數分鐘內加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當量的細胞核蛋白抽提試
  
  劑備用,在使用前數分鐘內加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。
  
  2.對于貼壁細胞:用PBS洗一遍,用細胞刮子刮下細胞,或用EDTA溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊,
  
  并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞,盡zui大努力吸盡上清,留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶
  
  消化細胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
  
  3.對于懸浮細胞:用PBS洗一遍,離心收集細胞,盡zui大努力吸盡上清,留下細胞沉淀備用。
  
  4.每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。(對于二百萬Hela細胞,其細胞
  
  沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)
  
  5.zui高速劇烈Vortex5秒,把細胞沉淀完全懸浮并分散開。(如果細胞沉淀沒有完全懸浮并分散開,可
  
  以適當延長vortex時間。)
  
  6.冰浴10-15分鐘。
  
  7.加入細胞漿蛋白抽提試劑B10微升。zui高速劇烈Vortex5秒,冰浴1分鐘。
  
  8.zui高速劇烈Vortex5秒,4℃12,000-16,000g離心5分鐘。
  
  9.立即吸取上清至一預冷的塑料管中,即為抽提得到的細胞漿蛋白。可以立即使用,也可以凍存。(千
  
  萬不要觸及沉淀,可以在沉淀上方保留極小體積的上清,以免觸及沉淀。)
  
  10.對于沉淀,完全吸盡殘余的上清,加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會
  
  帶來細胞漿蛋白的污染。)
  
  11.zui高速劇烈Vortex15-30秒,把細胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中,每隔1-2分鐘再高速
  
  劇烈Vortex15-30秒,共30分鐘。
  
  12.4℃12,000-16,000g離心10分鐘。
  
  13.立即吸取上清至一預冷的塑料管中,即為抽提得到的細胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃凍
  
  存。
  
  14.對于新鮮組織:
  
  A.把組織盡可能切成非常細小的碎片。按照20:1的比例混合適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A和B(例
  
  如200微升細胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成
  
  組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液,并在玻璃
  
  勻漿器內充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進行。
  
  B.勻漿后把勻漿液轉移到塑料離心管內,冰浴放置15分鐘。
  
  C.4℃1,500g離心5分鐘。把上清轉移至一預冷的塑料管中,為抽提得到的部分細胞漿蛋白。(吸上
  
  清時千萬不要觸及沉淀。)
  
  D.對于沉淀,到了這一步已經充分勻漿,但很多細胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開
  
  始操作,即把沉淀當做已經離心收集好的細胞沉淀操作,按照步驟4至步驟13抽提得到細胞漿蛋
  
  白和細胞核蛋白。抽提得到的細胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細胞漿蛋白合并。 上一篇 唾液酸受體有助阻斷流感病毒傳染 下一篇 超濾的應用
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